オオクチバス用のバイオフィルター培地の選択- バイオフィルムの特性と増殖性能
オオクチバス (Micropterus salmoides)、カリフォルニアバスとしても知られ、アクチノプテリギ、スズキ目、セントラキ科、ミクロプテルスに属します。アメリカのカリフォルニア州が原産で、生育が早く、味が良く、栄養価が高く、経済性が高いという利点があります。中国における重要な淡水養殖種の一つとなっています。近年、漁業の変革とアップグレード、デジタル漁業とインテリジェント漁業の精力的な発展を背景に、工業化された循環型養殖が徐々に台頭してきました。オオクチバスの水産養殖様式も、伝統的な池養殖から環境に優しい効率的な循環式養殖様式に移行しつつあります。循環式養殖には、水と土地の節約、高い飼育密度、管理の容易さなどの利点があります。物理的、生物学的、化学的方法と装置を通じて、水域内の固体浮遊物質や有害物質が除去されるか無害な物質に変換されるため、水質は養殖種の通常の成長ニーズを満たすことができ、それによって高密度の水産養殖条件下での水のリサイクルが実現します。-複数の養殖種において良好な経済的利益を達成しています。
現在、オオクチバスの循環養殖に関する研究は、繁殖、飼料の栄養、系統の選択、正確な給餌、水環境の変化、栄養の質に主に焦点を当てています。オオクチバスの屋内工業循環養殖に関する研究は、主に大型の稚魚の養殖に焦点を当てており、成魚のフルサイクル養殖は広く推進されていません。-オオクチバスの循環養殖が直面する主な課題は、養殖種の正常な成長を確保するために、高密度条件下で良好な水環境を維持することです。{4}}水処理は循環式養殖の中核であり、効率的な水処理バイオフィルター媒体は水処理システムの基礎です。バイオフィルター培地による水の浄化に関する報告は数多くありますが、特にオオクチバスの工業化循環水産養殖に関する報告、特に効果的な水処理バイオフィルター培地のスクリーニング、さまざまなバイオフィルター培地上のバイオフィルムの微生物群集構造、処理効果、養殖種の成長への影響に関する報告は不足しています。 3 種類のバイオフィルター媒体が選択されました。そのうち、角形スポンジと流動床ボールのバイオフィルター媒体は低コストで操作が簡単で、水産養殖の放水処理に広く使用されています。{8} Mutag Biochip 30（略称：Biochip）は、近年登場した新しいタイプのバイオフィルター濾材であり、耐衝撃性や長寿命などの利点を備えていますが、実用化効果は報告されていません。この目的のために、16S rDNA ハイスループットシークエンシング技術を使用して 3 つの水処理バイオフィルター培地のバイオフィルム形成状況を分析し、同時にオオクチバスの成長状況を分析して、実用的な水処理バイオフィルター培地を選別し、オオクチバスの工業化循環型養殖に効率的な水処理培地を提供しました。
1. 材料と方法
1.1 試験材料
このテストのために選択されたバイオフィルター媒体は次のとおりです。四角いスポンジ, バイオチップ、 そして流動床ボールに示すように、図1。正方形のスポンジ材はポリウレタン製で、一辺の長さ2.0cm、比表面積（3.2～3.5）×104m2/m3の立方体形状です。バイオチップの材質はポリエチレンで、直径 3.0 cm、厚さ約 0.11 cm、比表面積 5.5×103 m2/m3 の円形です。流動層ボールの材質はポリエチレン、有効比表面積は500~800m2/m3です。
1.2 実験的なグループ化
正方形のスポンジバイオフィルター培地処理グループをグループT1として設定し、対応する培地バイオフィルムをB1とラベル付けし、対応する水産養殖水をW1とラベル付けしました。バイオチップバイオフィルター培地処理グループはグループ T2 として設定され、対応する培地バイオフィルムは B2 とラベル付けされ、対応する水産養殖水は W2 とラベル付けされました。流動床ボールバイオフィルター培地処理グループをグループ T3 として設定し、対応する培地バイオフィルムを B3 とラベル付けし、対応する水産養殖水を W3 とラベル付けしました。
1.3 養殖システム
この実験は、浙江省淡水漁業研究所バリディアン総合実験基地の循環式養殖システムで実施された。培養槽は全部で９基、容量５００Ｌ、有効水量３５０Ｌであった。生物ろ過槽は縦８０ｃｍ、横５０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック水槽で、容量２００Ｌ、有効水量１２０Ｌであった。。培養タンクとバイオフィルタータンクは水ポンプで接続され、流量3〜4 L/minの内部循環を形成し、酸素添加のための曝気を行い、水溶存酸素は5 mg/L以上に維持されました。バイオフィルター培地はランダムにグループ化され、各タイプのバイオフィルター培地は 3 つの複製を持ち、各バイオフィルター タンクには 2.0 kg のバイオフィルター培地が充填され、同時に徐放性炭素源が懸濁されました。-バイオフィルム培養期間中、水を毎日 10% 交換しました。初期水質指標: 全窒素 (TN) 9.41 mg/L、全リン (TP) 1.02 mg/L、アンモニア態窒素 (TAN) 1.26 mg/L、亜硝酸態窒素 (NO₂⁻-N) 0.04 mg/L、過マンガン酸塩指数 (CODₘₙ) 3.73 mg/L.
1.4 試験魚および養殖管理
養殖種としてオオクチバスを用いた。試験開始前に、それらを再循環水中で 7 日間順応させた。テストは2022年8月11日から2022年9月22日までの42日間実施されました。。表面に傷がなく、健康で活き活きとしたオオクチバスをグループ化の対象として選択し、各養殖水槽に60匹の魚をストックし、1日2回給餌し、給餌時間は午前7時と午後16時で、1日の給餌量は魚の総体重の約1.0％〜1.5％を占めました。試験魚の初期体重は (20.46 ± 0.46) g でした。
1.5 サンプルの収集
バイオフィルタータンクからの水サンプルは 2 日ごとに収集され、水温、溶存酸素、pH 値などの指標を記録し、アンモニア性窒素と亜硝酸性窒素を測定しました。給餌量、実験開始時と終了時の魚の体重、生存率を記録した。実験後、滅菌水収集バッグを使用して各培養タンクから 1 L の水を収集し、0.22 μm フィルター膜でろ過し、後で使用するために -80 度の冷凍庫に保管しました。各バイオフィルタータンクから 0.5 g のバイオフィルター培地サンプルを無菌的に採取し、滅菌蒸留水に保管し、激しく振盪してバイオフィルム表面から微生物を除去し、その後 0.22 μm のフィルター膜でろ過し、後で使用するために -80 度の冷凍庫に保管しました。
1.6 測定方法
1.6.1 水質測定
水温、溶存酸素、pH値をセンサーで検出しました。HACH Hq40d ポータブル水質分析計。アンモニア態窒素濃度はネスラー試薬分光光度法を用いて測定した。亜硝酸態窒素濃度は塩酸ナフチルエチレンジアミン分光光度法を用いて検出した。
1.6.2 養殖性能測定
魚の増体率、飼料換算率、生存率の計算式は以下の通りです。
l 体重増加率= (最終的な魚の体重 - 初期の魚の体重) / 初期の体重 × 100%;
l 飼料換算率= 餌の消費量 / 体重増加。
l 生存率= (実験終了時の魚の数 / 実験開始時の最初の魚の数) × 100%。
1.6.3 微生物のハイスループットシーケンス-
細菌 DNA 抽出キット (OMEGA Biotech、米国) を使用して、水およびバイオフィルムから細菌 DNA を抽出しました。特異的プライマー 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') および 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') を使用して、細菌 16S rDNA の V3 および V4 領域を増幅しました。 PCR では TransGen AP221-02 反応システムを使用しました。4 μL の 5×FastPfu バッファー、2 μL の 2.5 mmol/L dNTP、0.4 μL の FastPfu ポリメラーゼ、0.8 μL の 5 μmol/L フォワードおよびリバースプライマー、0.2 μL の BSA、10 ng の DNA テンプレート、 ddH₂O を 20 μL に加えます。 PCR反応条件：95度、3分間。 95 度で 30 秒、53 度で 45 秒、72 度で 1 分間、28 サイクル。 72度伸展10分間。 ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ反応装置９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）、米国）で実施した。 PCR産物はビーズを使用して精製され、その後シーケンスが行われました。配列決定はShanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.に委託されました。
1.6.4 微生物の多様性分析
シーケンスから得られた生データは最初にスプライスされ、続いてリード品質とスプライシング効果の品質管理フィルタリング、およびシーケンス方向の補正が行われ、最適化されたデータが得られます。最終的に得られたCleanデータを正規化した後、OTU（Operational Taxonomic Units）クラスタリング分析と分類分析を97％の類似度で実行した。サンプルのヒストグラムは Excel を使用して描画され、ヒート マップは Majorbio Cloud Platform を使用して描画されました。
1.7 データ分析
差の有意性分析には SPSS 16.0 統計ソフトウェアを使用し、多重比較にはダンカンの分散分析法 (ANOVA) を使用しました。
2. 結果と分析
2.1 さまざまなバイオフィルター媒体のバイオフィルム形成時間
に示すように、図2、自然のバイオフィルム形成条件下では、バイオフィルタータンクの水中のアンモニア態窒素含有量は急速に増加し、その後徐々に減少する傾向を示しました。アンモニア態窒素含有量正方形のスポンジに相当するバイオフィルタータンクの水中の濃度は、17 日目に 8.13 mg/L でピークに達し、その後徐々に減少しました。41日目に最低値に達する、その後は約 0.20 mg/L に留まり、次のことを示しています。四角いスポンジのバイオフィルム形成時間は約17日でした。バイオチップに相当する生物濾過槽と流動層ボールの水中のアンモニア態窒素含有量の変化は基本的に同じであり、変動を示した。アンモニア態窒素のピークは 21 日目にそれぞれ 7.88 mg/L と 7.57 mg/L で現れ、次のことを示しています。バイオチップおよび流動床ボールバイオフィルター媒体のバイオフィルム形成時間は約 21 日でした。. アンモニア態窒素含有量に対応するバイオフィルタータンク内これら 2 つのメディアはそれぞれ 43 日と 45 日で最低値に落ちました。.
2.2 異なる培養タンクにおける水のpH値の変化
から図3, 培養水の初期のpH値は7.3であることがわかります。培養時間が長くなるにつれて、各培養槽内の水のｐＨ値は低下傾向を示した。 12 日後、すべての培養タンクの pH 値は 6.0 未満となり、培養種の生育には好ましくありませんでした。したがって、バイオフィルム形成から 12 日後は、培養タンク水の pH 値の調整に注意を払う必要があります。.
2.3 さまざまなバイオフィルター媒体および水中のバイオフィルム上の微生物群集組成の分析
2.3.1 門レベルでの微生物群集の構成
に示すように、図4、門レベルでは、3 つのバイオフィルター媒体のバイオフィルム上の優勢な細菌は同じで、すべてプロテオバクテリア、アクチノバクテリオタ、バクテロイドータ、およびクロロフレキシでした。それらを合計した相対存在量は、それぞれ 68.96%、64.74%、および 65.45% でした。対応する培養水中の優勢菌は異なりました。 W1 で優勢な細菌は Actinobacteriota で、相対存在率は 64.66% でした。 W2 と W3 で優勢な細菌はプロテオバクテリアで、相対存在量はそれぞれ 34.93% と 50.10% でした。
図. 4 門レベルでのさまざまなバイオフィルムおよび水中の細菌のコミュニティ構成
2.3.2 家族レベルでの微生物群集の構成
に示すように、図5、3 つの培地のバイオフィルムでは、細菌の約 48% が細菌群集であり、相対存在量はすべて 3% 未満でした。 B1 と B2 の優勢細菌は同じで、両方とも Xanthomonadaceae であり、相対存在量はそれぞれ 11.64% と 9.16% でした。 B3 の優勢な細菌は JG30-KF-CM45 で、相対存在量は 10.54% でした。培養水中の優勢な細菌は、バイオフィルター培地上の細菌とは異なりました。 W1 では Microbacteriaceae が絶対的に優勢な細菌であり、相対存在量は 62.10% でした。 W2 の優勢な細菌には、Microbacteriaceae (13.82%) のほかに、一定の割合の根粒菌 (8.57%) も含まれていました。 W3 で優勢な細菌は根粒菌目 (相対存在量 38.94%)、次にフラボバクテリア科 (相対存在量 15.89%) でした。
属レベルで上位 50 種が数えられました。数値を処理した後、サンプル中のさまざまな種の存在量の変化が、カラーブロックの色のグラデーションを通じて表示されました。結果は次のとおりです。図6。 W1 では Leifsonia が優勢な細菌で、相対存在量は 56.16% でした。 W2 で優勢な細菌は Leifsonia (10.30%) と Rhizobiales_Incertae_Sedis (8.47%) でした。 W3 で優勢な細菌は Rhizobiales_Incertae_Sedis で、相対存在量は 38.92% でした。バイオフィルム上で識別可能な細菌の中で、B1 ではサーモモナス属が優勢な属であり、相対存在率は 4.71% でした。 B2 と B3 の優勢な属はニトロスピラで、相対存在量はそれぞれ 4.41% と 2.70% でした。
図. 5 さまざまなバイオフィルム内の細菌のコミュニティ構成家族レベルでの水と
図. 6 属レベルでのさまざまなバイオフィルムと水の細菌群集組成のヒートマップ
2.4 -さまざまなバイオフィルター媒体のバイオフィルムおよび水中の微生物群集の多様性分析
に示すように、表1、異なる培地のバイオフィルム上の微生物群集のシャノン指数は、対応する培養水のシャノン指数よりも大きかったのに対し、シンプソン指数はその逆でした。対応する培養水を分析すると、W2 の細菌群集シャノン指数が最も高く、W1 および W3 よりも大幅に高かったのに対し、シンプソン指数は W1 および W3 より大幅に低く、その - 多様性が最も高いことが示されました。培養水の-多様性とは異なり、B2培地の細菌群集シャノン指数が最も大きく、シンプソン指数が最も小さいにもかかわらず、3つのバイオフィルター培地間に有意差はありませんでした。すべてのサンプルのシーケンス カバレッジは 0.990 を超えており、シーケンスの深さがサンプルの真のレベルを反映している可能性があることを示しています。
2.5 オオクチバスの成長に対するさまざまなバイオフィルター培地の影響
表2図は、さまざまなバイオフィルター培地グループにおけるオオクチバスの成長状況を示しています。 44 日間の培養後のオオクチバスの最終体重と体重増加率は、角型スポンジ養殖群が流動床ボール群やバイオチップ群に比べて有意に高く、飼料変換率は他の群に比べて有意に低かった。各グループのオオクチバスの生存率は 97% 以上で、グループ間に有意差はありませんでした。
3. 結論と考察
3.1 さまざまなバイオフィルター媒体のバイオフィルム形成時間
バイオフィルムはバイオフィルター媒体の表面に付着します。バイオフィルター媒体の材質、構造、比表面積は、バイオフィルムの形成に影響を与える主な要因です。バイオフィルムの培養には、自然バイオフィルム形成法と接種バイオフィルム形成法の 2 つの一般的な方法があります。バイオフィルム形成方法の違いは、バイオフィルムの成熟時間に影響します。胡暁兵ら。研究者らは、4種類のバイオフィルム形成法を用いた結果、キトサン、鉄イオンの添加、排出汚泥の接種などのバイオフィルム形成法を用いた場合、自然バイオフィルム形成法に比べてバイオフィルムの成熟時間が短くなることがわかった。有益な微生物や活性物質を添加することでバイオフィルムの形成時間を短縮することは可能ですが、種菌の入手が難しい、工程構成が複雑、コストが高いなどの問題があります。 Guan Minらは、有機物含有量が低い条件下で、バイオフィルム形成に原水を直接使用し、約38日後に自然なバイオフィルム形成によってバイオフィルタータンクを起動することに成功した。この研究結果は今回の研究結果と同様である。この研究の結果は、同じバイオフィルム形成条件下で、正方形スポンジのバイオフィルム形成時間が他の 2 つのバイオフィルター媒体よりも短いことを示しています。これは、角形スポンジの比表面積が大きいこと、親水性が強いこと、バイオフィルムが付きやすいことが関係していると考えられる。正方形スポンジの比表面積は 32,000 ～ 35,000 m²/m³ と高く、他の 2 つのメディアに比べてはるかに大きくなります。また、角型スポンジの材質はポリウレタンであり、水に濡れると膨張し、親水性が高く、水中の微生物が付着・増殖しやすい性質を持っています。 Li Yongらの研究結果。また、ポリウレタン スポンジの始動性能とアンモニア態窒素除去性能がポリプロピレンよりも優れていることも示しており、これはこの研究の結果と一致しています。さらに、本研究では、バイオチップバイオフィルター濾材の比表面積は 5,500 m2/m3 と高く、流動床ボール型バイオフィルター濾材よりもはるかに大きかったが、バイオフィルムの形成時間は基本的に流動床ボール濾材と同じでした。これは毛穴のサイズに関係している可能性があります。いくつかの研究では、バイオフィルター媒体の内部空間スケールがバイオフィルムの成長に影響を与えると指摘しています。一部のバイオフィルター媒体は大きな比表面積を持っていますが、その細孔は細かく、細孔サイズは成熟したバイオフィルムの厚さよりもはるかに小さいため、細孔の閉塞が起こりやすく、細孔内のバイオフィルムが最大の蓄積に達することが困難になります。バイオチップの細孔は小さいため、バイオフィルムの成長が遅くなり、バイオフィルムの形成時間が長くなります。
3.2 バイオフィルター培地と培養水の微生物群集組成
この研究では、バイオフィルター培地と対応する培養水の優勢な細菌は異なりました。バイオフィルター培地上のバイオフィルムのシャノン指数は、対応する培養水のシャノン指数よりも大きく、バイオフィルター培地が微生物を濃縮する効果があることを示しています。これは Hu Gaoyu らの研究結果と一致しています。担体の種類、フィルターの深さ、塩分濃度、有機物濃度など、微生物群集の構造に影響を与える要因は数多くあります。同じバイオフィルター培地でも、異なる培養条件下では、バイオフィルム上に異なる微生物群集が形成されます。著者はかつてテナガエビ (Macrobrachiumrosenbergii) の循環水産養殖システムにおける流動床ボールバイオフィルター媒体のバイオフィルム形成状況を研究したことがあります。結果は、そのバイオフィルム上の優勢な門はファーミクテス属であることを示しましたが、この研究では、流動床ボールバイオフィルム上の優勢な門はプロテオバクテリアでした。この違いの主な理由は、水産養殖環境の違いである可能性があります。この研究で使用した 3 つのバイオフィルター培地は、バイオフィルムを培養するための同じ初期条件を持っていました。培地の物理的特性が異なるため、形成されるバイオフィルムの厚さや内部環境も異なり、その結果、微生物群集に違いが生じた可能性があります。したがって、キャリアの違いが微生物群集の違いの主な理由です。さらに、水産養殖の過程では、水環境と微生物群集が相互に影響を及ぼします。微生物群集の違いの理由は、環境要因に関連している可能性があります。たとえば、Yuan Cuilin の研究は、体内の従属栄養細菌の総数が次のことを示しました。ファン・ティンギュ 他は、pH 値が水中の総窒素含有量に大きな影響を与える可能性があり、内陸河川部分の水生細菌群集の分布に重要な役割を果たしていると考えています。アンモニア態窒素、全リン、およびクロロフィル a も、水域内の細菌群集の組成にさまざまな程度で影響を与えます。この研究における微生物群集構成の違いを引き起こす環境要因については、さらに確認する必要があります。
3.3 オオクチバスの成長に対するさまざまなバイオフィルター培地の影響
成長結果から、四角海綿群のオオクチバスが最も早く成長し、他の 2 つの媒体よりも体重増加率が著しく高く、飼料変換率が最も低かった。これは以前の研究結果と一致しています。この研究では、バイオフィルムの形成と養殖を同時に実施しました。バイオフィルムの形成時間から判断すると、正方形のスポンジバイオフィルムはより早く成熟し、バイオフィルムが成熟した後、水中のアンモニア態窒素と亜硝酸態窒素の濃度は他の2つの媒体よりも常に低かった。また、角型スポンジは一定の濾過能力を有しており、養殖水中の固形浮遊物質の含有量が低く、水は比較的清澄であった。角海綿組のオオクチバスの成長が良好なのは、水質の良さに関係している可能性があります。ただし、水中の全窒素、全リン、過マンガン酸塩指数に対する角形スポンジ媒体の浄化効果については、さらなる研究が必要です。実験中、pH 値が全体的に低下傾向を示したことは注目に値します。 12 日間の培養後、すべての培養タンクの pH 値は 6.0 未満であり、これは Zhang Long らの研究結果と一致しています。 pH値の低下は、バイオフィルムの培養過程で水素イオンが大量に発生し、水のpH値が低下するためです。したがって、バイオフィルムの形成プロセス中に、培養タンク水のpH値が養殖種の正常な生育範囲内になるように速やかに調整する必要があります。経済コストを考慮すると、角型スポンジの市場価格は 70 ～ 100 RMB/kg であり、そのコストは他の 2 つのバイオフィルター媒体の中間にあります。成長結果と組み合わせると、短期的には、正方形のスポンジは循環水産養殖のための比較的実用的な水処理バイオフィルター媒体になります。しかし、角型スポンジは靭性が悪く、寿命が短い。その長期使用効果と養殖効果についてはさらなる検証が必要です。-
要約すれば、自然なバイオフィルム形成条件下では、正方形スポンジバイオフィルター培地はバイオフィルム形成時間が最も短く、価格も中程度であり、正方形スポンジグループのオオクチバスの最終体重と体重増加率は、他の2つのバイオフィルター培地よりも有意に高かった。短期的には、循環水産養殖のための比較的実用的な水処理バイオフィルター媒体となります。